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質(zhì)粒圖譜如何“瞅”

更新時間:2021-02-01      點擊次數(shù):2086

每當拿到一個質(zhì)粒圖譜,是不是一下就有點懵了?這些ori、RBS、tet是什么?這些箭頭代表什么,轉(zhuǎn)錄的方向嗎?不要著急,劍鈍生物把這些告訴你,也許會解決你的困惑。

質(zhì)粒和載體傻傻分不清楚
質(zhì)粒(Plasmid)是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子(即細胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型。

載體即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應(yīng)用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞),需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞,這種運載工具就叫做載體(vector)。細菌或病毒質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。

簡而言之,質(zhì)粒可以說是一個統(tǒng)稱,載體是質(zhì)粒改造過用來運載的工具

選用質(zhì)粒做載體的要求
以常用的為例
(1)選分子量小的質(zhì)粒,即小載體(1-1.5kb)→不易損壞,在細菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);
(2)一般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束,一般 10 個以上的拷貝,而嚴謹型質(zhì)粒<10 個。
(3)必需具備一個以上的酶切位點,有選擇的余地;
(4)必需有易檢測的標記,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr。
無論選用哪種載體,先都要獲得載體分子,然后采用適當?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進行切割,獲得分子,以便于與目的基因片段進行連接。

如何一眼看穿質(zhì)粒圖譜
①  復(fù)制起始位點Ori,了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒),Ori的箭頭指復(fù)制方向,其他元件標注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向(正向)。

②  再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記:
Ampr:水解β-內(nèi)酰胺環(huán),解除氨芐的毒性。
tetr :可以阻止四環(huán)素進入細胞。
camr:生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。
neor(kanr):氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。
hygr:使潮霉素β失活。

③  看多克隆位點(MCS):它具有多個限制內(nèi)切酶的單一切點(質(zhì)粒上只能有該內(nèi)切酶的*酶切序列,不然就一刀好幾段了),便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,而便于篩選,常見的是β-半乳糖苷酶的藍白斑篩選系統(tǒng)。

④再看外源DNA插入片段大?。嘿|(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA的片段。一般來說,外源DNA的片段越長,越難插入,越不穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化效率越低。

⑤ 是否含有表達系統(tǒng)元件,即啟動子(promoter)-核糖體結(jié)合位點(RBS)-轉(zhuǎn)錄終止信號(AATAAA同時是poly A)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體??寺≥d體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用那種載體,還是要以實驗?zāi)康臑闇世K。

⑥看報告基因:主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達的陽性判斷,表達成功的蛋白在小鼠體內(nèi)分布位置。
 
⑦看質(zhì)粒圖譜上的箭頭:它代表DNA兩條鏈(正義鏈和反義鏈),即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。
目的基因片段進行連接。

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